熒光分光光度計(jì)的工作原理

采用脈沖氙燈作光源（1μs半寬）保證測(cè)量結(jié)果有很好的重復(fù)性。高檔精密儀器配置：激發(fā)光部分和熒光發(fā)射部分,分別采用900條/mm凹面衍射光柵。檢測(cè)器采用高靈敏度高光電倍增管,倍增信號(hào)送計(jì)算機(jī)處理，最后將分析結(jié)果轉(zhuǎn)入顯示器的屏幕上顯示。

 

由光源氙弧燈發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸輪所控制，當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí)，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜，簡(jiǎn)稱(chēng)熒光光譜。

當(dāng)測(cè)繪熒光激發(fā)光譜時(shí)，將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處，只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的激發(fā)光的強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發(fā)光譜。

 

當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時(shí)，將激發(fā)光單色器固定在所選擇的激發(fā)光波長(zhǎng)處，將熒光單色器調(diào)節(jié)至所選擇的熒光波長(zhǎng)處，由記錄儀得出的信號(hào)是樣品溶液的熒光強(qiáng)度。

 

熒光分光光度計(jì)操作和使用

 

硬件操作

熒光分光光度計(jì)在使用時(shí)，需要注意開(kāi)機(jī)次序，以保護(hù)設(shè)備之間不受影響。熒光光譜儀開(kāi)機(jī)順序一般為先開(kāi)氙燈，然后開(kāi)儀器主機(jī)，最后開(kāi)跟儀器連接的計(jì)算機(jī)。如此操作的原因在于穩(wěn)態(tài)氙燈是高壓點(diǎn)亮，為了避免瞬問(wèn)脈沖電流對(duì)周?chē)O(shè)備造成影響，需要先開(kāi)氙燈，等電流穩(wěn)定后再打開(kāi)周邊的電腦等設(shè)備。關(guān)機(jī)順序則相反。

 

軟件操作

熒光定量分析多采用工作曲線法，即以已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度和空白溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度；扣除空白值后，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度，扣除空白值后，從工作曲線上求出熒光物質(zhì)的含量。

 

在用熒光分析法測(cè)定某些會(huì)引起熒光改變的微量物質(zhì)時(shí)，常采用差示熒光法，可使熒光強(qiáng)度的讀數(shù)差距拉大，使熒光強(qiáng)度的降低加大，從而提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。下面以日立F-4500熒光分光光度計(jì)的使用為例，具體介紹如何在儀器上進(jìn)圖譜掃描、濃度分析等定性、定量測(cè)試操作。

 

測(cè)試注意事項(xiàng)

熒光強(qiáng)度容易受外界因素的影響，如樣品池、激發(fā)光源、溫度、溶液的pH值、溶劑性質(zhì)、其它溶質(zhì)、表面活性劑等都會(huì)造成熒光強(qiáng)度的變化。嚴(yán)格控制測(cè)試條件對(duì)熒光分析來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

 

①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿(熒光池)中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。

②在熒光分析時(shí)，為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開(kāi)機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時(shí)間可以縮短到10min左右。對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(zhǎng)波長(zhǎng)、低入射光強(qiáng)度及短時(shí)間光照。

③溫度變化可引起熒光強(qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測(cè)試溫度變化不超過(guò)±3℃，對(duì)測(cè)試結(jié)果幾乎無(wú)影響。

④當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會(huì)發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會(huì)因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。以苯胺為例：在pH=7～12的溶液中會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色熒光，在pH<2或pH>13的溶液中都不產(chǎn)生熒光。再如，維生素B2(核黃素)在430～440nm藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光，λem為535nm。它在pH=6～7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在pH=11時(shí)熒光消失；但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnOt氧化下都會(huì)生成熒光強(qiáng)度比維生素B2強(qiáng)得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質(zhì)可提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。

⑤分子結(jié)構(gòu)中存在ππ共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，熒光效率顯著增強(qiáng)。溶液表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強(qiáng)度。儀器房應(yīng)注意經(jīng)常通風(fēng)，避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集。

 

使用熒光分光光度計(jì)要注意以下這些：

 

1、光源不要頻繁開(kāi)關(guān)

光源是儀器的重要組成部分且光源也有一定的使用壽命，所以在使用的過(guò)程中最好不要頻繁的去開(kāi)關(guān)，如果光源被關(guān)掉就要注意在光源完全冷卻了之后再重新開(kāi)啟，切不要?jiǎng)倓傟P(guān)掉又立即將光源打開(kāi)，這樣容易讓光源的壽命受到折損。此外，在日常使用時(shí)盡量要用手直接去觸摸光源，若不慎留下指紋應(yīng)該使用擦鏡紙沾無(wú)水酒精擦拭。

 

2、樣品室要經(jīng)常清潔

使用經(jīng)常會(huì)將樣品室弄臟，如果不及時(shí)擦拭干凈就會(huì)影響測(cè)試分析甚至?xí)舛扔?jì)造成損壞。所以，平時(shí)使用儀器的時(shí)候就要特別注意保護(hù)好樣品室，如果有樣品將其污染就要及時(shí)使用洗耳球吹掃或進(jìn)行擦拭。

 

3、光電倍增管要保持無(wú)塵

光電倍增管也是熒光分光光度計(jì)中的重要組成部件，使用儀器期間要注意經(jīng)常清潔光電倍增管的外殼確保外殼沒(méi)有灰塵積累，因?yàn)楣怆姳对龉苁且环N光敏原件，灰塵會(huì)對(duì)其敏感性造成不良影響，除了灰塵之外還要注意不要用手直接去觸摸外殼避免留下油脂和皮屑。