熒光分光光度計的工作原理是由光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)單色器變?yōu)閱紊?，照射在熒光池中的被測樣品上產(chǎn)生熒光；物質(zhì)產(chǎn)生的熒光被發(fā)射單色器色散為單色光，經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號，再經(jīng)放大器放大反饋到A／D轉(zhuǎn)換單元，模擬電信號即轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的數(shù)值，最后經(jīng)顯示器或打印機(jī)記錄被測樣品的譜圖，此時記錄的譜圖即為發(fā)射光譜，又稱為熒光光譜。

　　結(jié)構(gòu)組成：

　　熒光分光光度計的基本組成結(jié)構(gòu)包括：顯示系統(tǒng)、樣品室、單色器、激發(fā)光源、檢測器。

　　1、顯示系統(tǒng)：顯示系統(tǒng)由光度表、計算機(jī)操作系統(tǒng)等組成。

　　2、樣品室：通常由石英池架或固體樣品架組成。測量液體樣品時，光源與樣品成直角安排；測量固體樣品時，光源與樣品成銳角安排。熒光儀上用的樣品池與紫外可見分光光度計上用的樣品池存在較大差異。紫外可見分光光度計上用的比色皿材質(zhì)常為玻璃或石英，方形，兩面透光；而測熒光用的樣品池稱為熒光池，是用石英材質(zhì)制成，形狀也為長方形或方形，但四面透光。低溫?zé)晒鉁y定時還需在熒光池的外面再套一個充液氮的透明石英真空瓶。

　　3、單色器：用來分離出所需要的單色光。早期的熒光計是以濾光片來分離單色光，現(xiàn)在熒光分光光度計中應(yīng)用最廣的是光柵單色器。一般地，設(shè)備上裝有兩個單色器，激發(fā)單色器和發(fā)射單色器。置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器，篩選出特定的發(fā)射光譜。單色器上有進(jìn)、出光兩個狹縫，增大狹縫寬度則信號強(qiáng)度增強(qiáng)，減小狹縫寬度則分辨率增大。單色器的色散能力與雜散光水平是兩個重要的性能指標(biāo)，比較理想的單色器應(yīng)具有低雜散光，以減少雜散光對熒光測量的干擾，同時具有高色散能力，以便弱的熒光也可以被檢測到。

　　4、激發(fā)光源：常見的激發(fā)光源有高壓氙燈、高壓汞蒸氣燈、激光器、閃光燈等。高壓氙燈能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300～400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，成為目前應(yīng)用最多的連續(xù)光源。高壓氙燈的外殼為石英玻璃，內(nèi)部充壓力為5倍標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的氙氣，工作時壓力可達(dá)到20倍標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。以激光器作光源時，激發(fā)光強(qiáng)度大且單色性好，能極大地提高熒光分析的靈敏度。此外，目前商品儀器中應(yīng)用較多的閃光燈有氫燈、氮燈、脈沖激光燈等類型。

　　5、檢測器：是將光信號放大并轉(zhuǎn)為電信號，一般用光電管或光電倍增管（PMT）作檢測器。在一定條件下，PMT的電流量與入射光強(qiáng)度成正比，它測量的數(shù)據(jù)是眾光子脈沖響應(yīng)的平均值。加在PMT上的電壓越高，則其放大作用越大。但是，過大的電壓會造成PMT損壞，這點(diǎn)在實(shí)際使用中尤應(yīng)注意。電荷耦合器件陣列檢測器（CCD）是近年來出現(xiàn)的一類新型的光學(xué)多通道檢測器，檢測光譜范圍寬、暗電流小、噪聲低、靈敏度高，可獲取彩色、三維圖像。因其價格比較昂貴，常用在高檔熒光儀上。